Revisión

Del laboratorio a la clínica en el ictus isquémico agudo. Modelos experimentales in vitro e in vivo

J.M. Pradillo, A. García-Culebras, M.I. Cuartero, C. Peña-Martínez, M.A. Moro, I. Lizasoain, A. Moraga [REV NEUROL 2022;75:283-293] PMID: 36285448 DOI: https://doi.org/10.33588/rn.7509.2022268

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Volumen 75 | Número 09 | Nº de lecturas del artículo 4.330 | Nº de descargas del PDF 80 | Fecha de publicación del artículo 01/11/2022

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Introducción Ensayos in vitro. El inicio de los estudios en ictus Ventajas e inconvenientes del uso de modelos in vitro (frente a los modelos in vivo)Tipos de plataformas en los modelos in vitro Ensayos in vitro 2D Ensayos in vitro 3D Órganos en chip Terapia celular Modelos experimentales de ictus isquémico in vivo Modelo intraluminal Modelos de oclusión de la arteria cerebral media mediante electrocoagulación o procedimientos mecánicos Modelos tromboembólicos Técnicas de evaluación del daño isquémico y del estado funcional en el animal de laboratorio Conclusión

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RESUMEN

Introducción La enfermedad cerebrovascular es una de las principales causas de muerte, discapacidad y demencia en el mundo. La forma más frecuente de la enfermedad, el ictus isquémico, sólo tiene un fármaco disponible, el activador tisular del plasminógeno, y pocos pacientes pueden beneficiarse de esta terapia por los estrictos criterios de inclusión establecidos para su uso. Esta circunstancia hace crucial la búsqueda de nuevas formas de tratamiento para combatir las secuelas de la enfermedad, y para ello es necesario el desarrollo de nuevos modelos biomiméticos que permitan conocer mejor su evolución.

Desarrollo En esta revisión, actualizamos las plataformas y modelos más utilizados en los últimos años para estudiar la fisiopatología del ictus isquémico. Por un lado, repasamos las plataformas bi- y tridimensionales sobre las que se llevan a cabo los ensayos in vitro y, por otro lado, describimos los modelos experimentales in vivo más utilizados en la actualidad, así como las técnicas para evaluar el daño isquémico.

Conclusiones El desarrollo de buenos modelos experimentales tiene como fin último encontrar nuevas formas de tratamiento y, de esta manera, mejorar el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes; por ello, es importante generar nuevos dispositivos in vitro y refinar más aún los modelos in vivo para hacer posible una buena traslación a la clínica. Palabras claveEvaluación funcional del ictus Ictus isquémico In vitro In vivo Modelos Terapia celular CategoriasPatología vascular

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Introducción

La enfermedad cerebrovascular en España es la primera causa de muerte en mujeres, la primera causa de discapacidad en el adulto y la segunda en demencia. A pesar de la reducción en la mortalidad gracias a las unidades de ictus, se espera un incremento en su incidencia debido al aumento en la esperanza de vida y de factores de riesgo como la hipertensión o la diabetes [1,2]. En cuanto a su clasificación e incidencia, podemos distinguir dos grandes tipos, y el ictus isquémico (IS) es el más importante, porque supone el 85% de los casos de ictus y porque se produce por la oclusión de una arteria cerebral. Respecto a su tratamiento, este se reduce a la fibrinólisis con el activador tisular del plasminógeno y/o trombectomía mecánica. Esta última ha permitido tener acceso a los trombos, lo que está ayudando a detectar diferencias en su composición (fibrina, plaquetas, neutrófilos, etc.) que podrían explicar la ausencia de recanalización tras el tratamiento fibrinolítico en un alto porcentaje de pacientes, y está haciendo posible el estudio de nuevas terapias trombolíticas [3].

Todas estas razones hacen que la investigación en ictus sea esencial, y para llevarla a cabo se han desarrollado diferentes modelos experimentales, tanto in vivo como in vitro, que se describirán en esta revisión, haciendo hincapié en su valor traslacional. Además, se describirán diferentes técnicas para evaluar el daño cerebral/celular y el estado funcional del animal de experimentación.

**Ensayos in vitro. El inicio de los estudios en ictus**

Antes de probar la eficacia de un nuevo fármaco in vivo, es fundamental conocer su mecanismo de acción, así como su posible toxicidad farmacológica y la expresión génica en el ambiente isquémico. Para ello, es necesario recopilar la máxima información en ensayos in vitro, ya que son entornos controlados en los que se puede estudiar cada proceso biológico de forma aislada. En los modelos in vitro se persigue recapitular las condiciones isquémicas manipulando el ambiente celular a través de dos estrategias principales: mediante la eliminación del oxígeno y de la glucosa del medio o mediante la inhibición química o enzimática del metabolismo [4,5]. Además, deben tenerse en cuenta otros factores propios del ambiente isquémico, como la acidosis o la acumulación de metabolitos y desechos que conducen a la excitotoxicidad celular y a la consiguiente alteración de las funciones fisiológicas de las células afectadas. Para la eliminación del oxígeno y de la glucosa, lo más habitual es reemplazar el medio normal compuesto de O₂/CO₂ por N₂/CO₂, manteniendo a las células en una cámara hipóxica. Dependiendo de lo que se desee estudiar, existen variantes a la eliminación del oxígeno y de la glucosa. Por ejemplo, si se elimina el oxígeno, pero se mantiene la glucosa en la solución de incubación, se imita una situación de anoxia.

**Ventajas e inconvenientes del uso de modelos in vitro (frente a los modelos in vivo)**

Los ensayos in vitro presentan una serie de ventajas que los hacen más accesibles que los modelos in vivo. En primer lugar, son mucho más económicos y rápidos; además, como se mencionaba más arriba, son más reproducibles, porque se pueden controlar todas las variables del entorno. Por otro lado, se evita el componente ético del uso de animales de experimentación [6,7]. Respecto a sus inconvenientes, el más obvio es que, al tratarse de sistemas sencillos, se alejan mucho de los mecanismos e interacciones celulares que tienen los organismos vivos complejos (sobre todo, el ser humano), por lo que, a pesar de aportar indicios sobre los mecanismos fisiopatológicos y de acción de nuevos fármacos, los ensayos in vitro poseen limitada traslación a la clínica y necesitan ser corroborados en modelos in vivo.

Tipos de plataformas en los modelos in vitro

Actualmente existen múltiples plataformas para desarrollar modelos in vitro. En esta revisión se han dividido en dos bloques: los modelos en placa, que se plantean formando un cultivo en monocapa, a los que denominaremos bidimensionales o 2D; y los que se componen de distintos tipos de células y disponen de una estructura tridimensional o 3D (Fig. 1).

Figura 1. Los modelos in vitro llevados a cabo en plataformas 2D han permitido entender el comportamiento individualizado de las células humanas y han facilitado el desarrollo de las plataformas 3D para estudiar mecanismos de mayor complejidad que puedan asemejarse a los sistemas in vivo. Esto está permitiendo que nuevos fármacos y terapias celulares tengan más éxito en el tratamiento de la enfermedad.

Según esta distinción, también encontramos una serie de ventajas e inconvenientes (Tabla I). Si nos referimos a los cultivos 2D, a pesar de que son más simples, baratos y reproducibles, y permiten observar y cuantificar de forma sencilla el comportamiento celular, crecen en superficies planas, lo que no representa el crecimiento o interacción celular característicos de un organismo vivo. Además, al estar en un medio estanco, las cantidades de factores de crecimiento y de desechos celulares van variando y alterando el ambiente en el que se encuentran las células. Por su parte, los cultivos 3D son más relevantes por ser mucho más biomiméticos: permiten un grado de complejidad estructural más elevado, incluyendo las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, para mantener la homeostasis celular durante más tiempo [8], lo que también los hace más realistas. Además, integran microfluidos para estudiar cómo se adaptan las células diferenciándose o experimentando cambios metabólicos, y renuevan el medio para evitar que aumente la toxicidad; también mejoran la función específica de cada tipo celular y su expresión génica, por lo que la reacción a nuevos fármacos será más relevante.

Tabla I. Comparación del uso de las distintas plataformas para desarrollar modelos in vitro de ictus.
	Tipo	Soporte	Ventajas	Desventajas
Líneas celulares	2D	No	Alta disponibilidad y fácil manejo Estudio individualizado de tipos celulares Resultados muy reproducibles	Son demasiado simples y no se pueden estudiar interacciones entre distintos tipos de células
Células primarias	2D	No	Conservan las características fisiológicas del sistema biológico del que proceden	Vida natural muy corta El estado de las células depende de la edad y las condiciones del organismo del que proceden
Células madre	2D	No	Conservan las características fisiológicas del sistema biológico del que proceden Permiten disponer de cualquier tipo celular	Baja disponibilidad Baja tasa de reposición
iPSC	2D	No	Permiten disponer de cualquier tipo celular Proceden de células somáticas adultas Alta disponibilidad de la célula de interés	Desarrollan mutaciones en el proceso de reprogramación Producen alta inmunogenicidad en trasplantes alogénicos
Neuroesferas y esferoides	3D	No	Permiten estudiar interacciones celulares en 3D	Carecen de estructura cerebral
Organoides cerebrales	3D	No	Recapitulan la organogenia cerebral por su capacidad para autoorganizarse y generar distintos tipos celulares y tejidos Muy útiles para probar fármacos neuroprotectores	Falta de desarrollo vascular Se forma poca glía
Cultivo organotípico	3D	No	Las células mantienen su organización 3D original Permiten estudios de electrofisiología neuronal	Se puede mantener en cultivo cortos períodos de tiempo (Rodaja de cerebro adulto: 12 horas) Baja difusión de nutrientes y oxígeno
Órganos en chip	3D	Sí	Los que mejor emulan el microambiente fisicoquímico del cerebro	La tecnología para desarrollar los órganos en chip es cara
Oclusión de gran vaso	3D	Sí	Permiten ‘copiar’ el árbol arterial del paciente de estudio Vasos transparentes permiten visualizar la interacción del trombo y el vaso durante la trombectomía	No se representan bien las propiedades materiales de los vasos naturales Es caro disponer de los recursos necesarios para desarrollar el modelo
iPSC: células madre pluripotentes inducibles.

**Ensayos in vitro 2D**

Líneas celulares

El uso de líneas celulares estables sigue siendo muy extenso por su disponibilidad y fácil manejo en cualquier laboratorio y porque permiten estudiar la contribución de cada tipo celular que participa en el proceso patológico. Para desarrollar modelos de isquemia cerebral, tradicionalmente se realizaban cultivos de neuronas de ratón o rata o células de neuroblastoma humano [9]. Sin embargo, el uso de células de origen canceroso tiende a producir mutaciones genéticas y hace menos fiable su uso en modelos de ictus.

Células primarias

Son las que se aíslan directamente de los tejidos vivos y conservan las características fisiológicas de los sistemas biológicos de los que proceden. El mayor inconveniente que presenta su uso es que, en la mayoría de los casos, y a diferencia de las líneas celulares antes mencionadas, tienen una vida natural muy corta (sometida a senescencia y diferenciación) y su salud dependerá de la edad y la expresión génica del organismo del que se han aislado. Es el caso de las neuronas, que una vez que han madurado no tienen capacidad para replicarse. Las células que tienen una vida media más larga, como la glía, pueden perder la identidad fenotípica con el aumento de los pases [10].

Células madre

El uso de células madre supuso una revolución en el desarrollo de modelos de distintas enfermedades por la posibilidad de disponer de cualquier tipo celular inaccesible de otra manera. Las que se usan con más frecuencia son las células madre neurales, si la procedencia es animal, y las células madre mesenquimales, que se obtienen del tejido adiposo o de la médula ósea, en el caso de que la procedencia sea el ser humano.

Células madre inducibles humanas

En 2006 sucedió uno de los hitos más importantes para la investigación biomédica cuando Takahashi y Yamanaka consiguieron células madre pluripotentes inducibles, abriendo una puerta a las terapias personalizadas [11]. Las células madre pluripotentes inducibles proceden de células somáticas adultas que se reprograman a células madre al introducir cuatro factores de transcripción (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-myc) y, posteriormente, se diferencian del tipo celular de interés. Desde su descubrimiento se han desarrollado gran variedad de estrategias para evitar el desarrollo de mutaciones oncógenas, por lo que son las células más prometedoras para las terapias de reemplazamiento celular e ingeniería de tejidos.

Modelos de barrera hematoencefálica

La barrera hematoencefálica es una parte fundamental del proceso patológico del ictus, pues, al dañarse, causa la interrupción de la homeostasis cerebral. En los últimos años se han desarrollado una amplia variedad de modelos que están a caballo entre el 2D y el 3D. Los más básicos consisten en un sistema de ‘transwell’, en el que la permeabilidad puede controlar el traspaso de glucosa y también se puede medir la resistencia eléctrica transendotelial [12]. Muchos de estos modelos utilizan células madre pluripotentes inducibles humanas para obtener las distintas células que forman parte del modelo de barrera hematoencefálica [13,14]. En las revisiones de Nikolakopoulou et al y Tornabene et al [15,16], se describen con detalle las características que ha de tener un buen modelo de barrera hematoencefálica.

**Ensayos in vitro 3D**

Los cultivos 3D suelen categorizarse en los que tienen un soporte (scaffold) sobre el que crecerán las células y los que no lo tienen. Estos últimos se basan en la autoagregación de las células en placas especiales de baja adhesión que promueven la formación de esferoides. Por otra parte, para los primeros, el soporte puede ser de origen biológico, como hidrogeles de colágeno o gelatina, o sintético, como los compuestos por polietilenglicol o ácido hialurónico; existen otros más sofisticados que incluyen biorreactores, micropatrones impresos en la placa con chips compuestos por pequeños canales que permiten el desarrollo de cultivos con flujo [17]. Las impresoras 3D podrían revolucionar estos modelos, pero aún necesitan mejorarse los métodos para minimizar el impacto sobre el estrés celular y la reproducibilidad, y consensuar el componente bioético que ponga límites entre la reparación/sustitución de un tejido dañado y la mejora de éste, lo que rebasaría el concepto de lo natural para convertirlo en artificial [18]. De los cultivos 3D destacamos los siguientes como ejemplos.

Neuroesferas y esferoides corticales 3D

Se obtienen a partir de las células primarias cerebrales de las zonas neurogénicas (zona subventricular y giro dentado del hipocampo) y de la corteza, respectivamente, de animales de experimentación. Para obtener las esferas se utilizan sustratos que inhiben la adhesión, y gracias a su estructura se pueden estudiar las interacciones entre células tras someterlas a eliminación del oxígeno y de la glucosa [19].

Organoides cerebrales

Son tejidos que recapitulan la organogenia cerebral, con la limitación de la falta de desarrollo de vasculatura y de la baja proporción de glía [20]. Surgen de la diferenciación guiada de células madre pluripotentes [21,22] que, gracias a su capacidad de autoorganización, dirigirán la migración celular, la polarización del neuroepitelio y la generación de los distintos tipos celulares. Como resultado, se obtienen tejidos muy similares al cerebro humano, por lo que son una buena plataforma para testar agentes neuroprotectores que mejoren la traslación a la clínica.

Cultivos organotípicos o tisulares

Están a caballo entre los modelos in vitro e in vivo. Estos cultivos consisten en el mantenimiento ex vivo de una parte del tejido cerebral, normalmente procedente de embriones o neonatos de animales, que se deja madurar in vitro. Tienen la ventaja de que los distintos tipos de células mantienen su organización tridimensional, por lo que se puede estudiar la morfología y las relaciones celulares, como los circuitos neuronales mediante electrofisiología; se pueden mantener varias semanas. El principal inconveniente es la baja difusión de nutrientes y oxígeno. El equivalente en adultos humanos serían las rodajas cerebrales que se pueden perfundir con líquido cefalorraquídeo artificial manteniendo las células vivas hasta 12 horas.

Órganos en chip

Son sistemas de cultivo biomiméticos con pequeños canales microfluídicos transparentes revestidos de células, con condiciones que emulan el microambiente fisicoquímico del tejido cerebral. Hasta hoy, se han modelado distintos componentes cerebrales con funciones concretas, y también la barrera hematoencefálica. Un buen ejemplo es el modelo de unidad neurovascular compuesto por un vaso perfundido de células endoteliales cerebrales humanas en cocultivo con astrocitos y neuronas procedentes de células madre pluripotentes inducibles [23], en el que se mantiene la homeostasis controlando la entrada de moléculas desde la circulación. También se utilizan estos modelos para intentar mejorar los tratamientos personalizados [24]. Amirifar et al acaban de publicar una revisión con los avances en el diseño y técnicas de los cerebros en chip de que se dispone actualmente [25].

Modelos neurovasculares de oclusión de gran vaso

Además de estudiar el comportamiento de las células cerebrales en entornos isquémicos controlados, actualmente se desarrollan con éxito modelos de ingeniería de órganos ‘artificiales’ como simulaciones de trombectomía [26,27], usando vasos sintéticos y transparentes con trombos análogos que permiten la visualización de la interacción entre el trombo y el vaso durante la trombectomía.

Terapia celular

Las plataformas anteriormente descritas son la base para desarrollar estrategias terapéuticas que permitan trasplantar células u organoides como tratamiento neurorregenerador para reducir las secuelas en pacientes de ictus isquémico.

Actualmente, las células más utilizadas son las células madre mesenquimales, pero éstas, a pesar de exhibir capacidad regenerativa en estudios in vitro, en los modelos in vivo no han conseguido incorporarse al tejido del receptor después del trasplante, lo que probablemente se deba a que no cubren la alta tasa de reposición requerida [28]. De hecho, los efectos de recuperación observados en algunos modelos animales se atribuyen a los factores trópicos secretados por estas células [29-31]. Así, los exosomas liberados por las células madre mesenquimales podrían ser una nueva alternativa a la terapia celular. Por otro lado, las células madre pluripotentes inducibles parecen más prometedoras, ya que, además de que proceden de células somáticas adultas, lo que hace que haya mucha más disponibilidad, su incorporación al tejido en modelos animales es mayor [32]. Sin embargo, la generación de estas células es cara y requiere mucho tiempo; además, produce inmunogenicidad en trasplantes alogénicos e inestabilidad genómica en el proceso de reprogramación. Estos problemas están siendo solventados poco a poco gracias a la mejora en las técnicas de edición genómica (como CRISPR/Cas9), que podrían conseguir la generación de células madre pluripotentes inducibles sanas derivadas del paciente [33], aunque, por el momento, estos inconvenientes las mantienen alejadas de su uso en la clínica.

Modelos experimentales de ictus isquémico in vivo

En la mayoría de los pacientes, el ictus isquémico se produce por la oclusión de la arteria cerebral media, y los modelos experimentales que ocluyen dicha arteria son los mejor desarrollados y que más se acercan a la clínica. La mayoría de éstos se realiza fundamentalmente en ratas y ratones por presentar importantes ventajas, como bajo coste, similitud en la vasculatura cerebral con el humano y, en el caso del ratón, posibilidad de introducir modificaciones genéticas. Entre los modelos experimentales que se describen a continuación, algunos evitan la craniectomía (modelo intraluminal), y otros ocluyen directamente la arteria cerebral media de forma mecánica (modelo de la ligadura) o de forma más fisiológica (modelos tromboembólicos). Además, el hecho de ser tan diferentes está permitiendo generar experimentalmente distintos tipos de lesión y de coágulos, lo que recapitula bien la situación del ictus en clínica y está ofreciendo la posibilidad de evaluar nuevas terapias trombolíticas/neuroprotectoras.

Modelo intraluminal

Éste es uno de los modelos más utilizado a nivel experimental. Fue desarrollado originalmente por Longa et al en ratas y perfeccionado posteriormente por Kamii et al para su aplicación en ratones [34-36]. A pesar de ser un modelo bastante invasivo por seccionar de forma permanente diferentes vasos, es un modelo que evita la realización de craniectomía, lo que reduce lesiones cerebrales y preserva la presión intracraneal. Consiste en ocluir temporalmente la arteria carótida común e introducir una sutura a través de la arteria carótida externa transectada hasta ocluir de forma proximal la arteria cerebral media (Fig. 2a) [37]. Este método permite producir un ictus isquémico permanente o transitorio con reperfusión, y el uso de láser Doppler puede ser de utilidad para aumentar el éxito de la oclusión. Dentro del modelo transitorio, los tiempos más comunes de oclusión oscilan entre 60-120 minutos en ratas y 30-60 minutos en ratones, con una tasa de éxito de producir infarto que varía entre el 88 y el 100% [37,38]. Dependiendo de la duración de la oclusión de la arteria cerebral media, este método puede provocar un infarto de gran tamaño que afecte al estriado y a la corteza frontoparietal/temporal adyacentes, así como a estructuras alejadas, como el tálamo, el hipotálamo y la sustancia negra [39,40]. La reproducibilidad del infarto se ve determinada por el tipo, el diámetro y la longitud de la sutura, por la cepa, el peso y la edad del animal, y por la destreza del investigador para minimizar complicaciones derivadas de la cirugía, como hemorragia cerebral o subaracnoidea (Tabla I) [36]. Algunos inconvenientes importantes de este modelo son la alta mortalidad, la pobre recuperación del animal de experimentación durante las primeras horas tras la cirugía, el elevado tamaño del infarto, y su limitación para imitar la fisiopatología de las oclusiones transitorias o de las reperfusiones con trombolíticos [41]. A pesar de todo esto, el modelo intraluminal es de utilidad por reproducir el ictus isquémico humano con origen en la arteria cerebral media y, sobre todo, por reproducir a nivel experimental la trombectomía mecánica (Tabla II) [42].

Figura 2. Representación de los diferentes modelos de ictus isquémico en roedores. a) Modelo intraluminal. Inducción del modelo intraluminal mediante la inserción de un filamento; b) Modelo de oclusión de la ACM mediante ligadura; c) Modelo tromboembólico in situ; d) Modelo fototrombótico; e) Modelo de oclusión de la ACM mediante cloruro férrico. En todos los modelos se muestra la lesión isquémica mediante la tinción de TTC y mediante imágenes de resonancia magnética potenciadas en T2. ACA: arteria cerebral anterior; ACC: arteria carótida común; ACE: arteria carótida externa; ACI: arteria carótida interna; ACM: arteria cerebral media. ACP: arteria comunicante posterior; APT: arteria pterigopalatina; RM: resonancia magnética; TTC: cloruro de tetrazolio.

Tabla II. Comparación entre los diferentes modelos experimentales de ictus isquémico sobre la cirugía, el tipo y la magnitud de la lesión. Ventajas y desventajas.
	Características de la cirugía	Lesión y similitud con el IS humano	Ventajas	Desventajas
Modelo intraluminal	No craniectomía Oclusión permanente/transitoria Confirmación de la oclusión por láser Doppler	Lesión cortical, estriada y de estructuras alejadas del territorio de la ACM Infartos muy grandes	Conservación de la presión intracraneal (no craniectomía) Permite la reperfusión Simula bien la trombectomía mecánica	Alta mortalidad y mala recuperación del animal Reproducibilidad dependiente del peso del animal y del tipo/diámetro del filamento
Modelos de oclusión mecánica de la ACM	Craniectomía Oclusión permanente/transitoria Confirmación visual de la oclusión	Lesión cortical y rara vez estriada Infartos con tamaños similares a los observados en la clínica	Alta reproducibilidad Permite la reperfusión Buena recuperación del animal Modelos menos agresivos	Pérdida de la presión intracraneal Necesidad de mucha experiencia por el investigador
Modelo tromboembólico in situ	Craniectomía Inyección de trombina directamente en la ACM Confirmación de la oclusión por láser Doppler Oclusión permanente/transitoria	Lesión exclusivamente cortical Formación de trombo rico en fibrina Permite la reperfusión con rtPA Permite simular la TH debida a la administración tardía de rtPA	Alta reproducibilidad Buena recuperación del animal Modelo menos agresivo y altamente traslacional	Dificultad y duración de la cirugía Reperfusión espontánea Reproducción a nivel experimental de las cifras clínicas de reperfusión por rtPA y de TH
Modelo fototrombótico	No craniectomía Inyección de colorante fotoactivo e irradiación con láser	Lesión exclusivamente cortical Formación de trombo rico en plaquetas Infarto de evolución rápida y escasa penumbra, muy diferente al humano	Escasa invasividad Alta reproducibilidad Buena recuperación del animal Posibilidad de estudiar nuevas terapias trombolíticas	Rápida muerte neuronal Desarrollo simultáneo de edema citotóxico y vascular Escasa penumbra
Modelo de oclusión de la ACM por FeCl3	Craniectomía Oclusión mediante aplicación directa de FeCl3 Confirmación visual de la oclusión	Lesión exclusivamente cortical Formación de trombo rico en plaquetas	Escasa invasividad Alta reproducibilidad Buena recuperación del animal Fácil realización	Difícil reperfusión con rtPA
ACM: arteria cerebral meda; FeCl₃: cloruro férrico; IS: ictus isquémico; rtPA: activador tisular del plasminógeno; transformación hemorrágica.

Modelos de oclusión de la arteria cerebral media mediante electrocoagulación o procedimientos mecánicos

Éste es un grupo de modelos de ictus isquémico que requieren la realización de craniectomía tanto en ratas como en ratones, lo que supone el daño de algunas estructuras cerebrales y la consiguiente pérdida de la presión intracraneal. El primero descrito fue el modelo de electrocoagulación de la arteria cerebral media en su parte distal por Tamura et al en 1981, y posteriormente han surgido diferentes modificaciones [43-46]. Una de las modificaciones más utilizadas consiste en ocluir la arteria cerebral media mediante ligadura con suturas de 9/0 (Fig. 2b), clips de microaneurisma o por compresión, que puede ir acompañada con la oclusión en tándem de la arteria carótida común. Este modelo ofrece la posibilidad de inducir un ictus isquémico permanente o transitorio, y los tiempos oscilan entre 60 y 90 minutos, tanto para ratas como para ratones [47-51]. Estos modelos producen infartos de menor tamaño que el modelo intraluminal, dependiendo de si la oclusión es permanente o transitoria y si se ocluye o no la arteria carótida común. El daño isquémico se localiza en la corteza frontal, parietal y temporal, y muy rara vez en el cuerpo estriado. Sus principales ventajas, además de su alto valor traslacional por afectar al territorio de la arteria cerebral media, es que ofrecen una alta reproducibilidad del infarto y de los déficits neurológicos, son modelos menos agresivos que el intraluminal, con escasa mortalidad y con un porcentaje muy elevado de éxito, ya que la oclusión se puede confirmar de forma visual. El inconveniente que presenta esta técnica, además de la craniectomía, es que requiere manos muy expertas para la realización de la cirugía (Tabla II).

Modelos tromboembólicos

Estos modelos reflejan con mayor exactitud la fisiopatología del paciente de ictus isquémico, ofrecen la posibilidad de generar diferentes tipos de coágulos, y permiten la reperfusión del vaso mediante agentes trombolíticos y estudiar el efecto de estas terapias junto con nuevos agentes neuroprotectores.

El modelo tromboembólico in situ, descrito por Orset et al en 2007 en ratones, es uno de los modelos más traslacionales [52]. Consiste en la inyección de trombina en la parte distal de la arteria cerebral media, lo que promueve la formación de un trombo rico en fibrina, con la consecuente oclusión de la arteria. Es un modelo que permite la recanalización temprana con activador tisular del plasminógeno y la inducción de transformación hemorrágica debida al tratamiento tardío con este fármaco [53]. El infarto que produce es más pequeño que en los modelos anteriores, y se localiza fundamentalmente en la corteza (Fig. 2c). Entre sus inconvenientes cabe destacar la dificultad y la duración de la cirugía, sobre todo en los modelos de transformación hemorrágica, y la necesidad de monitorizar el flujo de la arteria cerebral media mediante láser Doppler y la recanalización espontánea del vaso observada en el 20% de los animales [53], y de realizar craniectomía, con las desventajas ya descritas. Respecto a sus ventajas, además de su elevado valor traslacional, este modelo reproduce a nivel experimental las cifras tanto de recanalización de la arteria cerebral media como de transformación hemorrágica observadas en la clínica (Tabla II).

Otro modelo de este grupo, desarrollado inicialmente en ratas y posteriormente en ratones, es el modelo fototrombótico [54,55]. Consiste en la inyección de un colorante fotoactivo (rosa de bengala), por vía intraperitoneal en ratones o por vía intravenosa en ratas, que, tras irradiar el cráneo intacto con un haz de luz a una longitud de onda específica, genera especies reactivas de oxígeno que producen la activación plaquetaria y la formación de un coágulo rico en plaquetas (Fig. 2d). Esto produce un infarto de pequeño tamaño en la región cerebral seleccionada, normalmente en el territorio de la arteria cerebral media, caracterizado por una rápida evolución de la lesión y escasa penumbra [56]. De entre sus ventajas cabe destacar la mínima invasividad de la cirugía, la elevada reproducibilidad de la lesión y una baja mortalidad. Además, la reducida concentración de fibrina y alta en plaquetas del coágulo, que dificulta su disolución con activador tisular del plasminógeno, hace que sea un modelo idóneo para estudiar el efecto de nuevas terapias trombolíticas [57]. Entre sus desventajas destaca la rápida muerte neuronal y el desarrollo simultáneo de edema citotóxico y vascular, y coagulación microvascular masiva si la zona iluminada es extensa, lo que difiere enormemente de lo ocurrido en la clínica (Tabla II).

Finalmente, el modelo de trombosis arterial mediante la aplicación de cloruro férrico, descrito inicialmente por Karatas et al en 2011 [58], consiste en la exposición mediante craniectomía de la arteria cerebral media y su oclusión distal mediante la aplicación directa de este compuesto durante varios minutos, lo que promueve la generación de especies reactivas de oxígeno y la agregación plaquetaria, dando lugar a la formación de un trombo rico en plaquetas (Fig. 2e). Al igual que el modelo anterior, el infarto que produce es pequeño y afecta fundamentalmente a la corteza. De entre sus ventajas, cabe destacar su escasa invasividad y fácil realización, que permite comprobar la oclusión del vaso de forma visual, con poca variabilidad del infarto entre individuos y escasa mortalidad [58]. Al producir un coágulo rico en plaquetas, hace difícil la reperfusión con activador tisular del plasminógeno, lo que permite, por otro lado, el estudio de mecanismos de resistencia a este fármaco, el ensayo de nuevas terapias trombolíticas y su combinación con fármacos neuroprotectores (Tabla II) [57].

Técnicas de evaluación del daño isquémico y del estado funcional en el animal de laboratorio

Tradicionalmente, en los modelos experimentales, la evaluación del daño isquémico se ha realizado mediante técnicas histológicas que, a pesar de ser bastante económicas, no permiten realizar estudios longitudinales sobre la evolución de la lesión. De entre todas estas técnicas, las más utilizadas para evaluar el tamaño de la lesión son la tinción de secciones de cerebro mediante sales de tetrazolio o mediante la tinción de Nissl, que permiten distinguir fácilmente el infarto del cerebro sano [59,60]. Otras técnicas también muy empleadas para evaluar el daño de la barrera hematoencefálica son la inmunotinción de inmunoglobulina G o la extravasación del colorante azul de Evans (Tabla III) [59]. Debido a la pobre traslación que ha existido hacia la clínica, se han publicado una serie de recomendaciones (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable–STAIR), entre las que se encuentran implementar el uso de técnicas de imagen, como la resonancia magnética y la tomografía de emisión de positrones, en modelos experimentales de ictus isquémico [61,62]. Estas técnicas, además de utilizarse en el paciente con ictus, ofrecen la posibilidad de realizar estudios longitudinales, lo que reduce el número de animales. Una de las más empleadas en experimentación es la resonancia magnética, que ofrece la posibilidad de obtener mucha información del mismo animal por sesión. En primer lugar, se pueden adquirir imágenes potenciadas en T₁ o T₂, lo que permite obtener información anatómica, de localización y de la dimensión del infarto. Además, la realización de otras técnicas, como la perfusión por resonancia magnética o la difusión por resonancia magnética, permiten una visualización directa del daño microestructural y de las alteraciones en la perfusión, y abren nuevas ventanas en la investigación del ictus. Concretamente, con la difusión por resonancia magnética se puede calcular el coeficiente aparente de difusión, que, junto con las medidas de perfusión, da una información importante sobre la extensión de la zona de penumbra, región potencialmente salvable durante la fase aguda, lo que permite evaluar experimentalmente nuevas terapias neuroprotectoras [63,64]. También con la administración de agentes de contraste (por ejemplo, gadolinio) y realizando la técnica de resonancia magnética dinámica mejorada con contraste, se puede determinar el daño en la barrera hematoencefálica y la función vascular en la región infartada de forma no invasiva (Tabla III) [65].

Tabla III. Técnicas de evaluación del daño isquémico y del estado funcional en los modelos de ictus isquémico experimental. Ventajas y desventajas.
Técnicas histológicas		Técnicas de resonancia magnética
Tinción con sales de tetrazolio Tinción con violeta de cresilo o tinción de Nissl Inmunotinción de IgG para evaluar daño en la BHE	Ventajas/desventajas	Imágenes potenciadas en T₁ o T₂ Difusión (DWI-MRI) o perfusión (PWI-MRI) Cálculo de mapas ADC para evaluar la penumbra DCE-MRI para evaluar el daño en la BHE y la función vascular	Ventajas/desventajas
	Sin estudios longitudinales Fácil realización No permiten diferenciar core de penumbra		Estudios longitudinales Equipos especializados Permite calcular la penumbra Algunas técnicas requieren administración de agente de contraste
Evaluación de la función neurológica
Test sensoriomotores		Escalas neurológicas
Rotarod Test del adhesivo Test del cilindro Test de la esquina		Escala de Bederson Escala mNSS
ADC: coeficiente aparente de difusión; BHE: barrera hematoencefálica; DCE-MRI: resonancia magnética dinámica mejorada con contraste; DWI-MRI: difusión por resonancia magnética; IgG: inmunoglobulina G; mNSS: Modified Neurological Severity Score; PWI-MRI: perfusión por resonancia magnética.

Finalmente, el hecho de que la forma de evaluar la gravedad y la evolución del paciente tras un ictus sea mediante la realización de pruebas funcionales, ha supuesto el desarrollo de diferentes test a nivel experimental. De todos ellos, los más empleados durante la fase aguda en los diferentes modelos animales van desde test como el rotarod, el del adhesivo, el del cilindro o el de la esquina para evaluar la función sensorial y motora, hasta escalas generales, como la escala de Bederson o la escala Modified Neurological Severity Score, que evalúan de forma rápida el estado funcional general del animal isquémico (Tabla III) [66-68].

Conclusión

El objetivo principal del desarrollo y la investigación en ictus isquémico tanto en modelos in vitro como in vivo es mejorar el tratamiento de esta patología en la clínica. Estos modelos, a pesar de ser una gran herramienta para ayudar a comprender los mecanismos bioquímicos y celulares básicos tras un ictus isquémico, siguen teniendo limitaciones para reproducir la gran complejidad fisiopatológica que se produce y se observa en el ictus isquémico en el paciente. Por tanto, para mejorar la traslación hacia la clínica sería necesario generar nuevos dispositivos in vitro, refinar más aún los modelos in vivo y considerar diferentes comorbilidades en el ictus isquémico experimental que asemejen aún más la situación exacta que se pretende imitar.

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From the laboratory to the clinic in acute ischaemic stroke. In vitro and in vivo experimental models

Introduction. Cerebrovascular disease is one of the leading causes of death, disability and dementia around the world. For the most common form of the disease, ischaemic stroke, there is only one drug available, tissue plasminogen activator, and few patients can benefit from this therapy because of the strict inclusion criteria established for its use. This circumstance makes it crucial to search for new forms of treatment to combat the sequelae of the disease, and this requires the development of new biomimetic models that allow for a better understanding of its evolution.

Development. In this review, we update the platforms and models most widely used in recent years to study the pathophysiology of ischaemic stroke. On the one hand, we review the two- and three-dimensional platforms on which in vitro assays are carried out and, on the other, we describe the most commonly used in vivo experimental models and techniques for assessing ischaemic damage.

Conclusions. The ultimate aim of developing good experimental models is to find new forms of treatment and thus improve patients’ prognosis and quality of life. It is therefore important to generate new in vitro devices and to further refine in vivo models to enable a good clinical translation.
Key words. Cell therapy. Ictus functional evaluation. In vitro. In vivo. Ischaemic stroke. Models.

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